Tematyka badawcza

 

Moje zainteresowania naukowe koncentrują się wokół tematyki związanej z oceną molekularnych podstaw chorób cywilizacyjnych człowieka.
W szczególności interesują mnie procesy na poziomie molekularnym, które towarzyszą, są przyczyną bądź też skutkiem procesu nowotworzenia. Nie mniej istotne i interesujące jest dla mnie poszukiwanie nowych markerów nowotworowych i poznawanie mechanizmów regulacji ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm komórki nowotworowej. Podstawowe metody wykorzystywane przez mnie w czasie prowadzenia badań to PCR oraz jej różne modyfikacje (RT-PCR, qPCR), a także metody oparte o analizę immunofluorescencyjną (western-blot, ELISA) oraz cytometryczną (ocena cyklu komórkowego, ocena poziomu fragmentacji DNA - TUNEL). Jedną
z najważniejszych ale i najtrudniejszych w optymalizacji okazała się metoda oceny aktywności TRAP, która łączy w sobie takie techniki jak PCR, ELISA oraz elektroforeza w żelu poliakrylamidowym PAGE. Doskonalenie i optymalizacja tej metody umożliwiło mi ocenę mechanizmów towarzyszących procesowi nowotworzenia na poziomie molekularnym, co z kolei pozwoliło mi lepiej poznać sam proces. Ta wiedza została przeze mnie wykorzystana do opracowania
i zaproponowania walidowanych metod diagnostycznych służących do wczesnego wykrywania zagrożenia rozwojem choroby nowotworowej [P9, P20, H5, H6].

W czasie realizacji wszystkich badań dostrzegałem konieczność stosowania metod specyficznych i selektywnych, które wyróżniają się jak najmniejszą ingerencją w organizm przy towarzyszącej jak największej czułości ale
i powtarzalności wyników badania. W tym obszarze badań szczególną rolę odgrywało opanowanie takich technik jak PCR w czasie rzeczywistym czy cytometria przepływowa oraz ELISA.

Uczestniczyłem w pionierskich na terenie naszego kraju badaniach z zastosowaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym (pierwsze tego typu urządzenie w Polsce miało swoją premierę w Katedrze Biochemii i Biologii Molekularnej, UMP), co umożliwiło mi dokładne poznanie metody oraz optymalizację wielu testów na potrzeby własne oraz współpracujących zespołów. Przydatność tej metody wykazałem w wielu ówczesnych jak i kolejnych badaniach […]. W pracy badawczej istotny był dla mnie aspekt nie tylko analityczny, polegający na poszukiwaniu nowych rozwiązań, ale także pożyteczny dla pacjenta i lekarza.

Na drodze do poszukiwania najlepszego czynnika docelowego, którego wyeliminowanie przyniosłoby najlepszy efekt w terapii nowotworowej zidentyfikowałem jeden z najbardziej specyficznych markerów charakteryzujących komórki nowotworowe czyli telomerazę.

U dorosłego człowieka komórki somatyczne nie wykazują aktywności tego enzymu, a więc z każdym kolejnym podziałem komórkowym dochodzi w nich do skrócenia długości sekwencji telomerowej. [Harley i wsp., 1990] Liczne badania na komórkach nowotworowych wykazały, że aż 85-90% z nich posiada aktywną telomerazę. [Shay i wsp., 1997; Kim i wsp., 1994] Co więcej, 100% gruczolakoraków, do których zalicza się między innymi raka piersi, wykazuje aktywność tego enzymu. [Kammori i wsp., 2002; Soria i wsp., 1999]

W moich badaniach doświadczalnych wykazałem, że telomeraza może stanowić atrakcyjny cel w terapii przeciwnowotworowej. Podjąłem działania zmierzające do poznania mechanizmu regulacji ekspresji genów kodujących poszczególne podjednostki kompleksu telomerazy co doprowadziło do zidentyfikowania cząsteczek kluczowych dla aktywności całego kompleksu.
W swych doświadczeniach badałem także inne potencjalne markery nowotworowe oraz związki o potencjale terapeutycznym […].

Badania prowadzę z wykorzystaniem komórek nowotworowych ustalonych linii o różnej charakterystyce (np. MCF7 i MDA-MB-231), a także z wykorzystaniem materiału śródoperacyjnego. Punktem odniesienia w poszukiwaniu mechanizmów specyficznych dla komórek nowotworowych są komórki prawidłowe (np. komórki śródbłonka naczyń aorty brzusznej HAAE2) lub komórki nienowotworowe (np. komórki MCF10A).

            Wykonane przeze mnie prace badawcze, niewchodzące w skład rozprawy habilitacyjnej, można podzielić na następujące grupy tematyczne:

  1. Badanie molekularnego podłoża nadciśnienia tętniczego w aspekcie ekspresji i aktywności dehydrogenazy 11-beta hydroksysteroidowej typu II [P1, P2, P6].
  2. Ocena roli polimorfizmów i ekspresji genów związanych
    z metabolzizmem ksenoestrogenów (CYP1A1, CYP1B1, CYP3A4, AHR, PXR) w patogenezie raka endometrium (P3, P4, P5).
  3. Badanie udziału leptyny i receptora leptyny w metabolizmie tkanki tłuszczowej [P8 oraz R3].
  4. Poszukiwanie nowych czynników ryzyka zachorowania na raka piersi [P15, P18].
  5. Identyfikacja nowych związków o potencjale terapeutycznym [P17, P20, P21, oraz R1 i M1]
  6. Inne publikacje [P9, P19].

 

Tematyka badawcza związana z nowotworami.

Molekularne cele terapii

W związku z postępem cywilizacyjnym i starzeniem się społeczeństw zachorowalność na choroby związane z wiekiem, w tym choroby nowotworowe, rośnie. Rośnie więc również zapotrzebowanie na identyfikację nowych celów i opracowanie nowych terapii, których efektywność i specyficzność zapewni skuteczne leczenie i poprawę jakości życia. Współczesne badania w zakresie poszukiwania biologicznie czynnych związków terapeutycznych pochodzenia naturalnego jak również syntetyzowanych w oparciu o bioinformatykę oraz modelowanie molekularne, wymagają wszechstronnych narzędzi, które pozwolą również na przyżyciową ocenę mechanizmu i efektywności ich działania. Taką funkcję spełniają narzędzia molekularne wykorzystywane w moich badaniach pozwalając na prowadzenie badań z zakresu cyklu komórkowego, proteomiki jak również genomiki na poziomie molekularnym i funkcjonalnym. Jednym z głównych problemów badawczych podejmowanych przez mnie w ostatnich latach jest zagadnienie dotyczące regulacji ekspresji telomerazy i jej aktywności, której odkrywców uhonorowano Nagrodą Nobla w 2009 roku. Ponieważ telomeraza jest jednym z czynników, który decyduje o potencjale proliferacyjnym komórek nowotworowych, jego badanie ma ogromne znaczenie terapeutyczne. W ramach badań zjawiska odbudowy telomerów dokonuje się analizy szeregu związków, których powinowactwo do telomerowych kwadrupleksów udało się już wykazać (Rubis et al., 2008). Potwierdzenie skuteczności działania związków wymagało badań ze szczególnym wykorzystaniem specyficznych i czułych metod jak cytometry przepływowy czy aparat do PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Jest to o tyle istotne, że wszelkie badania podstawowe o pewnym potencjale aplikacyjnym muszą uwzględniać konieczność planowania terapii, której specyfika będzie bardzo wysoką, a w konsekwencji poziom skutków ubocznych względem komórek prawidłowych osiągnie poziom minimalny. Dlatego tak ważny jest wybór molekularnego celu, który umożliwi skuteczna i specyficzną eliminację komórek nowotworowych. Jednym z takich markerów może okazać się telomeraza. U dorosłego człowieka komórki somatyczne nie wykazują aktywności tego enzymu, a więc z każdym kolejnym podziałem komórkowym dochodzi w nich do skrócenia długości sekwencji telomerowej. [Harley i wsp., 1990] Wyjątek stanowią komórki charakteryzujące się wysokim potencjałem regeneracyjnym, takie jak: komórki szpiku kostnego, skóry, układu pokarmowego, a także aktywowane limfocyty. W komórkach tych telomeraza odbudowuje telomery, pozwalając na liczne podziały, a tym samym umożliwiając regenerację tkanek. [Forsyth i wsp., 2002; Hathcock i wsp., 2005] Telomeraza jest także obserwowana w komórkach macierzystych i w komórkach linii zarodkowych. Aktywność telomerazy wykrywa się w wielu tkankach embrionalnych, a także u płodu i noworodków. [Wright i wsp., 1996] Wykazano jednak, że aktywność telomerazy w powyższych komórkach, nie jest wystarczająca do utrzymania długości telomerów. Wraz z wiekiem, dochodzi zatem do skracania się telomerów we wszystkich prawidłowych komórkach organizmu. [Artandi i wsp., 2010] Z kolei liczne badania na komórkach nowotworowych wykazały, że aż 85-90% z nich posiada aktywną telomerazę. [Shay i wsp., 1997; Kim i wsp., 1994] Co więcej, niemal 100% gruczolakoraków, do których zalicza się między innymi raka piersi, wykazuje aktywność tego enzymu. [Kammori i wsp., 2002; Soria i wsp., 1999] Co jednak najbardziej istotne, zarówno długość telomerów jak i aktywność telomerazy obserwowana w komórkach krwi obwodowej wydaje się korelować zarówno z procesem kancerogenezy czy metastazy jak i z wieloma cechami charakterystyki nowotworu (poziom metylacji, Her2, PGR, ER), co mogłoby umozliwić dobór skutecznej, celowanej terapii. Dotychczasowe wyniki prac dotyczących udziału telomerazy w procesie nowotworzenia są rozbieżne, co może wynikać z wieloczynnikowości procesu nowotworowego, różnych uwarunkowań etnicznych czy środowiskowych ale także z udokumentowanego już tkankowo-specyficznego mechanizmu regulacji telomerazy. Dotychczas wykazano już potencjalną możliwość wykorzystania diagnostyki ekspresji/aktywności telomerazy do prognozowania rozwoju raka szyjki macicy [Eid et al., 2011] oraz raka szyi [Porika et al., 2011]. Oczywistym jest fakt, że proponowane przez nas badania mogą dawać rozbieżne wyniki, co może z kolei wynikać z faktu, że indukcja ekspresji i aktywacja telomerazy przez jednych badaczy uważana jest za proces wtórny w stosunku do kancerogenezy, a przez innych za proces ją inicjujący. Dodatkowo, uzyskane wyniki mogą być uzależnione od momentu w którym pacjentki trafią z rozpoznaniem do szpitala, a to z kolei powinno dać więcej informacji o profilu ekspresji/aktywności telomerazy na różnych etapach rozwoju nowotworu. Wśród czynników posiadających pewien potencjał terapeutyczny wynikający z możliwości interakcji z telomerazą znajdują się tzw. stabilizatory kwadrupleksów, których właściwości i zdolność do interakcji z telomerami udało się wykazać w dwóch etapach. Najpierw udało się wykazać aktywność biologiczna grupy związków, pochodnych papaweryny drogą selekcji pod kątem ich cytotoksyczności względem komórek nowotworowych (Gałęzowska i wsp., 2007). W kolejnym etapie badań związków tej grupy udało się wyłonić związek o wysokiej cytotoksyczności ale i o specyficznym mechanizmie działania opartym na blokowaniu telomerazy. Efekt ten został zweryfikowany seria testów mających na celu wykazanie unikatowych właściwości związku, jego zdolności interkalacji tylko do struktur kwadrupleksowych i braku oddziaływania z innymi enzymami zaangażowanymi w metabolizm kwasów nukleinowych jak polimeraza (Rubiś i wsp., 2009).

 

Patoogeneza uwarunkowana czynnikami genetycznymi

Wśród przyczyn decydujących o patogenezie nowotworów decydują w ogromnym stopniu uwarunkowania genetyczne. Stąd istotnym problemem w diagnostyce jest identyfikacja nowych markerów genetycznych, których weryfikacja umożliwi określanie stopnia ryzyka lub wczesne wykrywanie i podjęcie działań zapobiegawczych (chemoprewencja). Do grupy tego typu czynników należą polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP, ang. Single Nucleotide Polymorphism) czy badanie poziomu metylacji genów zaangażowanych w kancerogenezę, co również stanowi przedmiot zainteresowań i badań habilitanta realizowanych we współpracy z Kliniką Onkologii UMP oraz Katedrą i Zakładem Biochemii i Biologii Molekularnej (Kruszyna i wsp. 2010 (a), Kruszyna i wsp. 2010 (b)). Przedmiotem moich badań było zbadanie częstości występowania oraz udziału polimorfizmów genów kodujących enzymy należące do rodziny cytochromów. Enzymy te, w swoisty sposób katalizują reakcje hydroksylacji a substratami w tych reakcjach SA m.in. ksenoestrogeny środowiskowe, na które jesteśmy narażeni w stopniu zależnym od miejsca pracy, zamieszkania, trybu życia itp. Jak się postuluje istotne znaczenie dla procesu kancerogenezy ma nie tylko podstawnik, który ulega modyfikacji ale i wolne rodniki generowane podczas tej reakcji. Stąd wydajność procesu, warunkowana obecnością polimorfizmów w genach kodujących cytochromy, a przejawiające się modulacją ich aktywności, ma swoje istotne znaczenie dla kumulacji zarówno mutagennych substancji jak i ich metabolitów w tkankach człowieka. Badania dotyczące znaczenia polimorfizmów genów CYP1A1, CYP1B1and CYP3A4 w patogenezie raka piersi zostały przedstawione w pracy (Ociepa-Zawal i wsp., 2009). Podobnie, nie tylko polimorfizmy ale i regulacja ekspresji genów kodujących poszczególne enzymy I fazy oraz receptory pośredniczące w metabolizmie ksenobiotyków mają swoje ogromne znaczenie dla patogenezy nowotworów (Ociepa-Zawal i wsp., 2007).

 

Aspekt terapeutyczny

Dane epidemiologiczne na przestrzeni ostatnich lat wskazują na olbrzymią i rosnącą liczbę zachorowań na choroby o podłożu nowotworowym. Na jednym z czołowych miejsc pod względem zarówno zachorowalności, jak i śmiertelności jest nowotwór gruczołu piersiowego. Według różnych szacunków, na świecie rocznie zostaje zdiagnozowanych około 11,3 miliona nowych przypadków nowotworów złośliwych, a u około 7,9 miliona ludzi są one przyczyną zgonu. Jak się szacuje 520.000 zgonów rocznie na świecie spowodowanych jest wystąpieniem raka piersi. W Polsce w roku 2006 nowotwory złośliwe stanowiły drugą przyczynę zgonów, powodując ponad 26% zgonów wśród mężczyzn i 23% wśród kobiet. W związku z alarmującymi danymi odnośnie zachorowalności na raka piersi wśród kobiet, postanowiono podjąć się próby zbadania możliwości zastosowania nowoczesnych narzędzi biologii molekularnej do wykrywania i identyfikacji procesu nowotworzenia na jego wczesnym etapie. Podejście takie daje możliwość niezwykle czułej i specyficznej identyfikacji, a w efekcie wczesnego reagowania, co jest warunkiem koniecznym do skutecznego zwalczania nowotworu. Co więcej, jak się sugeruje, znajomość profilu ekspresji specyficznych markerów komórek nowotworowych, daje możliwość doboru i prognozowania o skuteczności terapii.

Badania mające na celu identyfikację patogenezy oraz sposobów leczenia nowotworów opierają się także o badania mechanizmów związanych ze zjawiskiem oporności wielolekowej (MDR, ang. multidrug resistance) komórek nowotworowych, które odpowiedzialne jest za ograniczanie skuteczności terapii przeciwnowotworowych (Rubis et al., 2010). Celem zwiększenia efektywności tych terapii konieczne jest poszukiwanie nowych leków cytostatycznych oraz określanie mechanizmów ich działania, co jest możliwe dzięki zastosowaniu szybkich, nowoczesnych technik badawczych, które zapewniają jednoczesną ocenę kilku parametrów.

Wszelkie badania mające na celu opracowanie nowych terapii powinny uwzględniać konieczność weryfikacji proponowanych strategii w oparciu o badania na komórkach prawidłowych tak, aby wyeliminować lub jak najskuteczniej ograniczyć możliwość wystąpienia skutków ubocznych jej stosowania. Takie badania poprzedziły moja analizę skuteczności fitosteroli, których potencjalny efekt przeciwnowotworowy zaproponowałem w aspekcie suplementacji diety (Rubis i wsp., 2008).

 

Aspekt regeneracyjny???

Modele badawcze wykorzystywane do analizy nowotworów stanowią zarówno komórki macierzyste, hodowle pierwotne wywodzące się z materiału śródoperacyjnego jak i ustalone linie komórek nowotworowych i prawidłowych (Rubis et al., 2008). Te pierwsze badane są w aspekcie zdolności regeneracyjnych uszkodzonego rdzenia kręgowego (we współpracy z Kliniką Neurochirurgii). Nie bez znaczenia pozostał jednak fakt odkrycia komórek macierzystych nowotworu.

Problemy będące przedmiotem badań habilitanta doskonale wpisują się w ogólnoświatowy trend zarówno zapobiegania jak i leczenia chorób człowieka a w szczególności: oceny markerów nowotworowych, chemoprewencji, lekooporności, chorób związanych z wiekiem itp.